什么是WB?

蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot，简称WB，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。WB是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中某种蛋白的方法，具有高分辨力、高特异性和高敏感性等优点。

WB的原理是什么？

Western Blot的原理是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以抗体为“探针”，通过标记的二抗检测目标蛋白质的方法。经过电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的蛋白样品其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白情况。

WB应该怎么做？

一、蛋白质的提取

1.组织蛋白提取

（1）将少量组织块置于1～2ml匀浆器中，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎；

（2）加400μl单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆，结束后置于冰上；

（3）几分钟后再匀浆一会儿再置于冰上，要重复匀浆几次使蛋白充分释放出来；

（4）裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000 rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。

2.细胞蛋白提取

（1）弃去培养液， 加预冷的PBS清洗细胞。重复三次；

（2）加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，经常来回摇动，使细胞充分裂解；

（3）裂解后，将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪转移至1.5ml离心管中（整个操作尽量在冰上进行）；

（4）4℃下12000 rpm离心5min；

（5）将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于-20℃保存。

二、蛋白浓度测定

使用BCA protein quantitation kit，根据说明书操作分别检测标准品和样品的吸光值，进行曲线拟合，计算出样品蛋白浓度，蛋白浓度测好后，加loading buffer煮样，蛋白变性用于跑胶检测。

三、SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳

（1）凝胶配制：12%的分离胶，5%的浓缩胶，分离胶所用溶液见表1，浓缩胶所用溶液见表2；

表1

表2

（2）电泳：

1.将准备好的凝胶夹在电泳芯中，放置到电泳槽中，往槽中加入电泳液，如果同时跑两块胶，则液面达到下方刻度线，如果跑四块胶，则液面需要到达上方刻度线，内槽中电泳液需加满至溢出；

2.缓慢垂直向上拔出点样梳，上样前将上样孔中的气泡赶尽 (若有)，使用特定的凝胶上样枪头或10μL的枪头上样；

3.盖上电泳槽，开启电源进行电泳（注意电极），浓缩胶的电压通常为80V（约20min），分离胶的电压通常为120V；

4.当染料分子溴酚蓝到达凝胶的底部时，关闭电源。

四、转膜

1.提前配置转膜缓冲液，准备甲醇溶液；

2.活化PVDF膜：PVDF膜使用前需在甲醇中活化；

3.切胶：用ddH2O冲洗胶块后切除浓缩胶和溴酚蓝，在转膜缓冲液中平衡3-5min，留下含有目的蛋白的凝胶；

4.转膜，从负极到正极依次是海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵，100V，转膜1-2h。

 

五、封闭

封闭液：5%脱脂奶粉溶液，将PVDF膜放入封闭液中，室温摇床上缓慢封闭2小时。

六、一抗孵育

按照抗体说明书稀释抗体，4℃孵育过夜。

七、二抗孵育

TBST溶液漂洗PVDF膜3次，每次10 min，按照说明书稀释抗体，一般1:5000，室温孵育2 h。

八、曝光

配制ECL发光液，A液和B液的比例为1：1避光混匀，现用现配。用TBST溶液漂洗PVDF膜3次，每次10 min。使用蛋白凝胶成像仪进行曝光，保存图像后，用image J软件进行定量分析。

WB应该注意什么？

（1）蛋白提取时裂解液的体积根据组织总量来决定，不宜过多，蛋白会被稀释，不宜过少，损失蛋白；

（2）蛋白浓度不建议低于1μg/μl；

（3）为减少非特异性结合，建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间；

（4）洗膜时间和次数需根据具体实验进行调整，清洗过少会产生过高背景；清洗过度会洗脱目的蛋白或降低信号；

（5）抗体不建议回收和重复利用。

示例图（使用抗体为Abcam，ab183999，稀释比例为1:1000，显色时间1秒）